폐암은 전 세계적으로 남녀 모두에서 사망률과 사망자수가 가장 많아 암으로 사망하는 사람의 약 30%에 이른다. 폐암은 임상적인 경과와 치료 방법에 따라 소세포폐암과 비소세포폐암으로 대별되고 폐암 환자의 약 85%가 비소세포폐암에 해당된다. 폐암 환자의 대부분은 말기에 진단을 받기 때문에 나쁜 경과를 가지는 경우가 많다. 최근 수 십년간 말기 비소세포폐암 환자에 대한 항암치료제가 개발되어 시술되었지만 소수의 환자만이 효과를 보았으며 항암제의 독성으로 인해 많은 환자들이 부작용을 경험하는 문제점이 있다¹⁾. 2019년에 전세계적으로 창궐하여 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)는 계속적인 변이로 인해서 현재도 명확한 치료제가 개발되지 않았으며, 암 또는 폐질환 등의 기저질환을 가진 사람이 더 취약하여 중증으로 발전될 가능성이 높으며²⁾, 또한 현재 사용하는 치료를 위한 약물들의 부작용 또한 계속하여 보고되고 있다³⁾. 천연물의 생리활성 물질은 다성분으로 각기 다른 비율로 구성되어서 이 중 약리학적으로 유효한 효과를 내는 활성성분들은 생체 내에서 면역세포를 활성화하고, 외부에서 유입되는 항원에 대한 항체의 생성을 촉진시키며, 체내 생화학적 수치들을 정상화하는 등의 효과 등을 복합적으로 가지므로 여러가지 질환을 예방하고 치료하는 기능을 가진다. 따라서 이들을 치료하거나 예방하기 위한 천연화합물의 소재에 관심이 높아지고 있다⁴⁾.

전통적인 한약재로 다용 되는 한해살이 풀인 형개(Schizonepeta tenuifolia)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하며 지상부 전초를 사용한다. 특이한 냄새가 있으며 입 속에 넣으면 약간 시원한 느낌이 있다⁵⁾. 중국 북부지방이 원산지로서 중국의 하남, 하북, 산동 등에서 주로 재배되며 한국에서도 약용식물로써 각지에서 재배되고 있다. 한의학에서는 각종 염증성 질환과 알레르기 비염, 피부 가려움, 상기도 감염 등의 증상에 사용하는 처방에 사용되는 약재로 활용되고 있다. 이외에도 산후의 중풍 및 대하증 등의 치료제로 사용하며, 열을 가하여 탄화 시킨 형개를 지혈제로 활용하기도 한다. 형개가 사용되는 대표적인 의료보험처방으로 형개연교탕과 연교패독산이 있으며, 동의보감에서는 콧물이 나오는 감기에 사용되는 처방으로 형개를 주성분으로 하는 황련통성산, 필징가환, 양격산 등이 소개되고 있다⁶⁾.

본 연구에서는 호흡기 질환에 많이 활용하고 있는 형개를 사용하여 비소세포폐암 치료에 적용할 가능성을 고려하여 잠재적 활성성분과 관련 타깃 유전자를 네트워크 기법을 활용하여 약리학적으로 생체내에서의 작용을 예측하고 세포독성실험을 통해서 증명하였다. 이를 통하여, 기존에 연구되었던 항균과 항바이러스효과 뿐만 아니라 아직 연구되지 않았던 항암효과에 대한 생물정보학적 기초자료와 실험적 증명을 제시하고자 한다. 또한 본 연구는 증류수를 용매로 한 형개 추출물을 활용하기에 추후 약침 원재료로 활용할 수 있는 가능성 또한 제시하고자 한다.

1. 활성성분 분석

형개의 활성성분을 분석하기 위하여 Traditional Chinese Medi-cine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php, accessed on 11 Jan-uary 2024)을 이용하여 荊芥, Schizonepeta tenuifolia Brique의 검색어로 검색하여 총 159개의 구성성분을 찾았다⁷⁾. TCMSP는 한약재 각 성분의 약동학적 성질과 표적, 질병 등에 대한 정보를 제공한다. 약물의 흡수와 분포, 대사, 배설(ADME, absorption, distribution, metabolism, extraction)에 근거를 둔 분자량 크기(MW, 180-500 Daltons), 약리화(Drug-Likeness, DL), 생리활성도(Oral Bioactivity, OB), 장내흡수도(Caco-2 permeability, Caco-2) 값을 기준으로 스크리닝하였다. DL 값은 생체 내에서 예측되는 약리 활성에 대한 값으로 값이 높을수록 생리 활성이 높다. 본 논문에서는 DL값을 0.10 이상으로 설정하였다. OB값은 구강 투여된 물질이 위장관, 간, 소장 등 생체 내에서 용해되어 활성성분으로 흡수되는 수치로 약동학에서 가장 중요한 척도이다. 본 연구에서는 OB값 35% 미만은 제외하였다. Caco-2는 구강 투여된 약물이 가장 많이 흡수되는 소장에서의 흡수도로 약물의 체내 흡수력을 예측하는 척도이다. 본 연구에서는 Caco-2 값 -0.4 미만은 제외하였다⁸⁾. 그 결과 형개의 구성 화합물질 중 생체 내 약리학적 활성이 큰 11개의 성분을 스크리닝하였다.

2. 타깃 단백질 수집

활성성분과 연관된 모든 타깃 유전자는 UniProt database (http://www.uniprot.org)를 이용하여 각 유전자의 정보를 확보하였다. 수집한 유전자에 연관된 생체대사 과정을 찾기위하여 DAVID 6.8 Gene Functional Classification Tool을 사용하였고 p값은 0.01 미만으로 설정하였으며, Benjamini-Hochberg 방법으로 p값을 보정하였다⁹⁾.

3. Pathway 네트워크 분석

유전자가 연관된 Pathway를 네트워크화하여 mapping하여 생체내에서의 작용을 예측하였다. 분석은 유전자의 생체내에서의 기능을 빅데이터로 정리한 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)의 시스템(https://www.genome.jp/entry/hsa04140, accessed on 21 January 2024)을 사용하였다.

본 연구에서 사용된 형개는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 2021년에 구입하였다. 물은 3차 증류수를 사용하였으며, 메탄올은 SK chemical (Seongnam, Korea)의 HPLC 등급을 사용하였으며, 기타시약은 모두 99.9% 이상의 등급을 사용하였다. 형개의 추출과정은 다음과 같다. 20 g의 형개를 800 ml의 증류수에서 60℃로 3시간 동안 추출 한 후, 상등액을 분리하였다. 상등액은 감압증류기에서 증류한 후 동결건조하여 분말형태의 추출물을 5%의 수율로 얻었다. 세포는 비소세포폐암 세포주인 A549세포를 사용하였다. 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을 함유한 DMEM 배지를 사용하였다. FBS, penicillin-streptomycin 및 배지는 Gibco (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 배지는 2∼3일마다 교환하였으며 세포가 80% 이상 자랐을 때 phosphate buffered saline solution (PBS)으로 세척한 후 cell scraper를 사용하여 계대배양하였다.

1. 세포 독성 실험

분말형태로 얻은 형개를 증류수에 용해하고 0.2 μm 기공의 필터로 거른 후 세포독성 실험을 통하여 A549세포에 대한 세포사멸 효과를 확인하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 cell viability assay를 실시하였다. 100 μl (10,000 cells/well)의 세포 부유액을 96 well plate에 분주 후, CO₂ 배양기 안에서 24시간 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 형개추출물을 10% FBS가 함유된 DMEM 배지와 함께 시간대별로 배양하였다. 배양 후 각 well에 10 μl의 CCK-8 용액(Dojindo, Tokyo, Japan)을 첨가했다. 1시간 동안 CO₂ 배양기 안에서 반응을 시킨 뒤 microplate reader를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포사멸정도를 확인하였다.

2. 통계 및 검정

통계학적 검정 각 실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t-test 한 후, p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.

1. 활성성분 분석

성분분석결과 생체내에서 약리학적으로 활성성분이라 할 수 있는 형개의 유효성분들을 정리하여 Table 1에 정리하였다. 총 159개의 잠재적 유효성분이 검색되었으나, 위에서 제시한 활성성분 분석을 통하여 약리화(Drug-Likeness, DL), 생리활성도(Oral Bio-activity, OB), 장내흡수도(Caco-2 permeability, Caco-2) 등의 조건을 통하여 약동학적으로 생체내에서 작용할 수 있는 가능성이 높은 유효성분은 11개이다. 유효성분들을 보면, β-sitosterol과 Stigmasterol은 식물계에 널리 분포되어 있는 식물성 스테롤 중의 하나이다. β-sitosterol 배당체는 pH 3∼8범위에서 높은 항균력을 나타내었으며, 살모넬라 균주에 대한 돌연변이원성 연구에서도 안정성이 입증되었다¹⁰⁾. Stigmasterol은 약리학적 효능이 높아 항생효과와 항염증효과에 더하여 항암제로서의 활용 가능성 또한 보고되고 있다¹¹⁾. Luteonin은 암세포 신생혈관의 생성을 억제하여 세포사멸을 억제하는 연구가 보고되었고¹²⁾, 과일류에 산화방지제로 알려진 Quercetin은 강력한 항산화효과로 MEK/ERK와 Nrf2/keap1 pathway에 관여하여 염증과 암세포 신생혈관생성을 억제하여 다양한 암세포의 억제에 활용할 수 있음이 보고되었다¹³⁾. 형개의 지표성분으로 알려진 Pulegone은 항산화 효능과 살충작용 등이 보고되어 있지만 DL값이 설정한 기준치에 미달하여 포함시키지 않았다.

2. 활성성분이 관여하는 유전자 분석

위 분석 결과에 따른 11개의 활성성분별로 관여하는 유전자는 중복을 포함하여 346개이며, 이를 찾아서 도식화한 빅데이터를 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1. Compound-target network of Schizonepeta tenuifolia with 155 nodes.

생체내에서 약리학적으로 활성성분이라 할 수 있는 형개의 유효성분들중 Quercetin은 155개의 유전자의 메커니즘에 관여하여 가장 많은 수를 나타내었다. 활성물질들에서 가장 많이 관여되는 단독유전자는 5번 연관이 된 항염증작용에 관여하는 Cytochrome c oxidase I (COX1) 유전자이다. 세포사멸에 관여하는 Caspase 유전자들과 면역세포인 interleukin 유전자들의 경우, 형개의 활성물질들의 생체대사 과정 중 연관되는 유전자에 대한 네트워크 분석을 통하여 각각 9번과 10번 연관되었음을 확인하였다. 암세포에서 발현되는 Heat shock protein 90 kDa alpha, class B, member 1 (HSP90AB1) 유전자도 형개의 활성성분 중 4개에 영향을 받는다. 위의 결과들을 통해, 형개의 주요 활성 성분이 생체 내 면역시스템과 항균, 항염증 작용뿐만 아니라 항암작용에 있어서도 역할을 할 수 있음을 시사하며, 이 분석 결과를 토대로 주요 타깃과 활성성분을 선별하여 효율적으로 실험적 검증을 진행할 수 있는 기반을 마련하였다.

3. 형개의 활성성분이 관여하는 생체 내 pathway 분석

활성성분에 연관된 유전자들 중 중복을 제외하여 212개의 유전자를 추려내었고, 이들이 관여하는 생체내에서의 pathway를 예측하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Gene Ontology Analysis: top 32 processes out of 104 processes associated with Schizonepeta teunifolia target genes.

암의 pathway에 관여하는 gene이 63개로 가장 많았고, 이외에도 면역세포의 활성과 관련하여 항염증, 항바이러스의 경로, 당뇨, 관절염 등에 관여하는 유전자가 다수를 차지함을 확인하였다.

위의 결과들을 정리하면 형개가 임상에서 약물로 주로 쓰이고 있는 항염증과 항바이러스 등의 인체의 감염병용과 관련된 기존의 연구결과들을 뒷받침하는 분석이며, 약리학적 분석을 통해서 가장 많은 수의 pathway가 연관되어 있음에도 불구하고 기존에 연구되지 않은 항암작용에 대한 연구와 실험적 검증의 필요성을 설명하는 결과이다.

4. 세포 독성

유사분열 억제의 pathway로 A549를 사멸시키는 Taxol¹⁴⁾을 대조군으로 비교하여 형개추출물의 농도별, 시간별 세포독성을 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. 2.5 wt%의 형개추출물을 사용하면 대조군 수준 또는 그 이상의 수준까지 세포독성이 있음을 확인하였다. 대조군은 약품처리 시간에 따라서 세포독성이 높아지는 반면, 형개추출물의 세포독성효과는 8시간에서 48시간까지 세포생존율의 변화가 크지 않다. 그러므로 형개추출물의 약품처리 시간에 대한 변수는 세포생존율에 비교적 크게 작용하지 않음을 알 수 있다.

Fig. 3. Cell survivals in A549 lung cancer cell line. The data are presented as mean±SD of three independent experiments. Statistically significant differences were denoted as *p<0.05 and **p<0.01 when compared with the corresponding control group.

항암제와 병용투여를 하여 병용투여의 가능성을 실험하였다. 유사분열 억제의 pathway로 A549를 사멸시키는 Taxol과 Topoisomerase II 효소의 작용을 억제하여 A549의 apoptosis를 유도하여 세포생장을 억제하는¹⁵⁾ Doxorubicin (Doxo)을 대조군으로 비교하여 형개추출물과 복합적인 세포독성을 실험하였다. 병용투여시 세포독성효과는 Doxorubicin과 함께 투여하였을 때 20% 가량 증가하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Cell survivals in A549 lung cancer cell line using synergetic effect with Taxol and Doxorubicin (Doxo). The data are presented as mean±SD of three independent experiments. Statistically significant differences were denoted as *p<0.05 and **p<0.01 when compared with the corresponding control group.

형개는 약 0.5∼1.8%의 휘발성분을 함유하며, 주요한 약리학적 성분으로는 Menthone, Pulegone과 소량의 D-limonene이다. 그 외의 flavonoid로는 l-isomenthone, Isopulegone, Piperitenone 등의 Monoterpene과 Caryophyllene, β-elemene, β-humulene 등의 Sesquiterpene이 있다¹⁶⁾. 이 중 주요 성분인 Pulegone이 가지는 항염증효과를 활용한 아토피성 알레르기 반응에 대한 치료연구¹⁷⁾와 독성이 낮은 D-limonene의 담석 용해작용과 항암작용에 연구가 보고된다¹⁸⁾. 형개의 지표성분으로 알려진 Pulegone은 항산화 효능과 살충작용 등이 보고되어 있지만 DL값이 설정한 기준치에 미달하여 이 연구의 분석기준에서는 인체에서 효과가 미미할 수 있다고 설명된다. 그러나 유효성분이라는 점은 약리학적 분석 뿐만 아니라, 성분이 생약에 함유된 양과 추출법과 추출율 등 다양한 변수를 고려해야 하므로 한약재와 각각의 성분마다 다양한 관점에서의 분석이 필요하다.

형개의 항염증, 항바이러스효과에 대한 연구를 살펴보면 형개가 사용되는 대표적인 한약복합처방인 형개연교탕을 활용하여 ovalbumin에 의하여 유도된 알레르기 비염 유발 생쥐에 대하여 호산성 백혈구를 감소시키고, 비점막상피의 손상 완화 및 염증유발유전자를 조절하는 전사인자인 Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB)를 억제한 연구가 있었고¹⁹⁾, 또한 알레르기 접촉피부염에 대하여 histamine, 혈중 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)의 농도를 감소시켰다는 연구가 있었다²⁰⁾. 형개를 단독사용한 세포실험으로 면역세포 중 자연살해세포(natural killer cell; NK cell)의 활성에 대하여 유의한 증진효과가 있었음을 확인하였고²¹⁾, 정상면역세포에 관한 연구로는 세포독성을 나타내지 않으면서 비만세포인 P815 cell의 세포군락형성을 억제하였다는 연구와, 형개와 형개에서 추출한 주요성분 중 Rosemarinic acid 등은 human mast cell에 대하여 Inter-leukin 6 (IL-6), IL-8 그리고 TNF-α의 분비량을 유의하게 감소시켰다는 연구 등이 보고된다²²⁾. 형개를 단독사용한 항염증효과에 대한 동물실험으로는 형개의 아토피 피부염 동물모델에 대한 급성 anaphylaxis 반응의 억제와 함께 혈중 총 IgE, TNF-α와 IL-6를 억제함에 대한 효과가 확인되었고²³⁾, 알레르기 비염 동물 모델에 대한 히스타민 억제 및 임상증상에 대한 완화 효과를 확인하였다^24,25). 항바이러스에 대한 효과를 알아보기 위하여 수행한 연구로는 노로바이러스 증식억제에 대한 실험으로 HG23 세포가 형개 추출물로 증식이 억제됨을 확인한 연구가 보고된다²⁶⁾. 형개의 항암작용에 대한 연구로는 형개의 주요성분을 분석하는데 있어서 microfluidic 기법을 적용하여 분석하였을 때, 폐암세포의 증식에 대한 억제작용이 있는 화합물들이 주요성분으로 발견되었음을 연구한 결과가 보고되고 있으나²⁷⁾, 실제로 항암에 대한 연구는 충분하게 보고되지 않고 있다. 조사한 바와 같이 형개는 호흡기질환과 면역조절 관련한 질병에 널리 쓰이고 있는 약재로서, 폐암에 적용 가능성을 확인하기 위하여 비소세포폐암을 타겟으로 활성성분 분석 및 유전자 분석과 세포실험을 수행하였다.

형개가 가진 159개의 활성성분들을 약동학적 분석과 생체 내 대사과정을 고려하여 분석하였을 때, 이 중 11개의 활성성분이 생체 내에서 약리학적으로 주요한 역할을 할 수 있었다. 형개가 임상에서 약물로 주로 쓰이고 있는 항염증과 항바이러스 등의 감염병 및 면역조절과 관련되는 기전 뿐만 아니라 암의 pathway에 관여하는 gene이 63개로 가장 높은 빈도로 인체내에서 대사할 수 있음이 확인되어 형개의 항암제로서의 활용가능성을 확인할 수 있었다.

증류수를 사용한 형개추출물의 농도별 A549세포에 대한 세포독성 실험결과를 보면 농도의존적으로 세포사멸 효과를 나타내었고, Taxol과 비교를 통하여 암세포 사멸효과가 있음을 확인할 수 있다. 항암제와 병용투여한 세포독성 실험결과를 보면, 병용투여시에는 항암제와 형개추출물의 사용량을 각각 절반으로 줄여서 실험하였음에도 항암제만 단독으로 사용하였을 때 보다 더 세포 사멸효과가 높게 나타났다. 천연물질의 다양한 유효성분이 복합적으로 발현되기 때문에 세포 독성 기전은 하나로 단정 지을 수는 없으나, Doxorubicin의 세포사멸 작용과 다른 기전으로 작용하는 기전이 주된 요소로 작용하여 Doxorubicin과의 A549세포에 대한 세포사멸의 시너지효과가 더 크다고 예측할 수 있다. 또한 에탄올이나 메탄올 등으로 추출한 조건이 아닌 용매로서 증류수를 사용하였기 때문에, 경구투여제로 활용 뿐만 아니라 인체에 직접 주입하는 약침으로 활용이 수월하며 활용가능성 또한 높다. 따라서 본 연구결과는 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 형개가 항암약물로서 가능성이 있으며, 기존 항암제와 복합적으로 사용해서 항암제 사용량을 줄여 항암제 사용에 대한 부작용을 완화시킬 수 있음을 시사한다. 그러나 세포독성 실험 결과에서 처리시간대 별로 세포생존률이 형개추출물 처리 농도에 따라서 경향성이 달라지는 요인과 항암제와 병용 투여시 적절한 형개추출물의 농도 및 항암제와의 병용투여 비율 등에 대해서는 차후 DNA분절실험 등의 연구를 통해서 어떤 기전이 주된 요소인지는 확인할 수 있으므로, 앞으로 형개의 항암효과에 관한 기능을 세포 내에서 명확하게 규명하여 암의 예방과 치료에 관한 중요한 자료를 제공해야 할 것이다.

비소세포폐암 치료에 형개를 사용할 가능성을 고려하여 형개의 잠재적 활성성분과 관련 타깃 유전자를 네트워크 기법을 활용하여 약리학적으로 작용을 예측하고, A549세포주에 대한 항암효과를 실험적 증명을 통하여 약침 및 항암제로의 가능성을 관찰한 결과, 아래와 같은 결론을 얻었다.

1. 형개는 유효성분의 네트워크기법을 이용한 약리학적 분석에서 암과 관련된 pathway에 가장 많은 관여를 하였다.

2. 증류수를 사용한 형개 추출물의 A549세포를 이용한 세포사멸 효과에서 형개는 농도의존적인 생존억제 효과를 나타내었다.

3. Taxol과 Doxorubicin 항암제와 병용투여를 통한 실험에서 항암제의 용량을 줄이면서 더 높은 세포사멸 효과를 나타내었다.

이상의 연구결과를 종합하여 볼 때 형개를 항암제로 사용할 수 있는 가능성을 네트워크 약리학적 분석으로 확인하였으며, A549 인체폐암세포에 대하여 농도의존적으로 세포사멸 효과가 있었으며, 앞으로 형개를 응용한 복용약 및 약침으로써 암 치료를 위한 제재로의 활용을 위한 추가연구를 통해 형개의 역할을 밝힐 수 있을 것이다.

None.

This research was supported by (Basic Science Research Program) through the (National Research Foundation of Korea [NRF]) funded by the (Ministry of Education) under grant (NRF-2021R1I1A 1A01058697).

The authors can provide upon reasonable request.

저자들은 아무런 이해 상충이 없음을 밝힌다.