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Effects of Sunbanghwalmyung-Eum Gamibang on MIA-Induced Osteoarthritis in Rats
흰쥐에서 MIA로 유발된 골관절염에 선방활명음 가미방이 미치는 영향
Korean J Acupunct 2022;39:152-171
Published online December 27, 2022;  https://doi.org/10.14406/acu.2022.025
© 2022 Society for Meridian and Acupoint.

You Bin Shin , Han Byeol Park , Jae Su Kim , Hyun Jong Lee , Sung Chul Lim , Yun Kyu Lee
신유빈ㆍ박한별ㆍ김재수ㆍ이현종ㆍ임성철ㆍ이윤규

Department of Acupuncture & Moxibustion, College of Korean Medicine, Daegu Haany University
대구한의대학교 한의과대학 침구의학교실
Correspondence to: Yun Kyu Lee
Deprtment of Acupuncture & Moxibution Medicine, Pohang Korean Medicine Hospital of Daegu Haany University, 411 Saecheonnyeon-daero, Nam-gu, Pohang 37685, Korea
Tel: +82-54-271-8010, Fax: +82-54-281-7464, E-mail: hanyeesarang@hanmail.net
Received November 3, 2022; Revised November 24, 2022; Accepted November 25, 2022.
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Objectives This study was designed to investigate the effects of Sunbanghwalmyung-eum gamibang on Monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis rats.
Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were divided into 5 groups of 8 rats each. Osteoarthritis (OA) was induced by injecting MIA (2 mg/50 μl) into the joint cavity of the left knee of SD rats belonging to the experimental group, and normal saline was injected into the joint cavity of the left knee instead of MIA in the normal group. To the normal group and the controlled group (OA group), 2 ml of distilled water was orally administered. To the positive control group (Indomethacin group), indomethacin 2 ml at a concentration of 2 mg/kg, to the low concentration group of SHG (Low group), 2 ml of SHG at a concentration of 2 mg/kg, and to the high concentration group of SHG (High group), 2 ml of SHG at a concentration of 4 mg/kg ml was orally administered. The drug was administered for a total of 4 weeks, and histological changes were analyzed by Hematoxylin-Eosin staining and Safranin-O staining. In addition, inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, and IL-6, and MMP-13, TIMP-1, and GAGs were immunohistochemically analyzed. Finally, hematological examination, blood biochemical examination, and liver and kidney biopsy were performed.
Results SHG groups (Low and High) inhibited the matrix destruction and damage of the knee joint cartilage in SD rat model, and significantly prevented the reduction in cartilage thickness. In SHG groups, the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-6 and MMP-13 were significantly decreased, and the expressions of TIMP-1, GAGs were significantly increased compared with OA group. The safety indicators had no significant differences among five groups.
Conclusions These results show that SHG has cartilage protection capacity, anti-inflammatory effect.
Keywords: Sunbanghwalmyung-eum, osteoarthritis, monosodium iodoacetate (MIA), cartilage protection
서 론

골관절염(osteoarthritis, OA)은 연골의 퇴행, 마모 혹은 골극 형성과 같은 증식성 변화 등으로 관절 기능의 문제와 통증을 야기하는 만성 관절 질환이다.

골관절염의 치료는 크게 보존적 치료와 수술적 치료로 분류할 수 있고, 이 중 보존적 치료는 통증을 조절하고, 관절 기능과 삶의 질을 개선하는 것을 목표로 한다1).

한의학에서의 골관절염은 대체로 痺症의 영역에서 설명되며, 歷節風, 鶴膝風 및 脚氣症 등의 범주에 포함하기도 한다. 병인에 따라 補氣血, 補肝腎, 溫經脈, 散風濕, 散寒濕, 淸熱滲濕, 淸熱解毒, 消腫止痛, 利濕祛風 및 活血 등의 치료법을 선택하는데, 구체적 치료 도구로 침구, 약침, 도침, 한약 및 매선 요법 등이 활용되고 있으며, 최근까지 이러한 한방치료가 진통과 관절 가동 범위 개선, 연골 보호 및 연골 세포의 재생 등에 유효한 것으로 보고되고 있다2).

특히, 골관절염에 대한 한약 치료에 효과에 대해서는 大羌活湯3), 朮附湯4), 知栢地黃湯5), 三氣飮6), 疏風活血湯7) 및 大防風湯8) 등의 처방을 활용한 연구 결과가 보고되었으나, 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 膝腫痛에 사용할 수 있는 仙方活命飮에 대한 구체적인 연구는 아직 보고된 바가 없다.

仙方活命飮은 역대 서적에서 약물 구성에 약간의 변화는 있었으나, 淸熱 및 消腫止痛, 排膿, 活血散瘀 하는 효능으로 염증성 질환과 종양 등에 널리 활용되어 왔다9). 최근까지 仙方活命飮에 대한 연구로 소염, 진통, 해열 작용10), pro-inflammatory mediator에 미치는 영향11), mouse cell에서의 항산화, 항알러지 및 항염증 효과12), 항염 작용에 대한 실험적 연구13), 항균 효과14) 및 항암 효과9)에 대해 보고되었다. 이러한 내용들을 바탕으로 仙方活命飮의 효과를 증대시킬 것으로 기대되는 약물을 추가 배합하여 구성된 仙方活命飮 加味方 (Sunbanghwalmyung-eum gamibang, 이하 SHG)이 골관절염에 유효한 효과가 있을 것으로 보고 본 연구를 시행하였다.

이에 본 저자는 monosodium iodoacetate (MIA)를 이용하여 무릎의 골관절염을 유발한 rat 모델에 4주 동안 SHG를 투여하여 관절 연골의 육안적 관찰 및 병리조직학적 검사, 조직의 염증성 cytokine, 연골의 손상 및 손상방어 관련 인자, 항산화 관련 인자를 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 실험동물

본 연구는 약 250 g 전후의 10주령 Sprague-Dawley (SD) 계 수컷 흰쥐(SD rat, (주)샘타코, 경기도, 대한민국) 40마리를 사용하였다. 흰쥐는 온도(23∼24℃)와 습도(40∼60%)가 유지되고, 12시간 명암이 자동 조절되는 사육실에서 사료와 무균 음수를 자유 공급하여 사육하였으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

본 연구의 전체 과정은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 규정 및 방침에 따라 진행되었다(승인번호(IRB No.): R2020).

2. 仙方活命飮 加味方 시료 추출

본 연구에 사용된 SHG는 ≪證脈•方藥合編≫15)에 제시된 처방에 蒲公英과 牛膝을 추가하고 穿山甲을 제외하여 사용하였으며(Table 1), 사용된 약재는 (주)나눔제약(경북, 대한민국)을 통해 구입하였다. SHG 4첩 분량인 235.2 g을 증류수 2 L (시료 중량의 약 10배 용량)를 용매로 하여 둥근 바닥 플라스크(Pyrex, Corning Inc., New York, NY, USA)에 담은 후, 냉각기를 부착한 전기약탕기(DW-790, 대웅바이오, 경기도, 대한민국)에 2시간 전탕하고 한약 부직포를 통해 여과하였다. 여과액은 1 L rotary evaporator (Eyela, Tokyo, Japan)을 이용하여 감압 농축 후 freeze-drying하여 물 추출 엑기스 52.3 g (수득률 22.2%)을 얻었다.

The composition and amount of Sunbanghwalmyungeum gamibang

Herb name Pharmacognostic name Amount (g)
金銀花 Lonicerae Flos 8.0
當歸尾 Angelicae Gigantis Radix Palva 6.0
陳皮 Citri Unshius Pericarpium 6.0
牛膝 Achyranthis Radix 6.0
蒲公英 Taraxaci Herba 6.0
甘草 Glycyrrhizae Radix 4.0
天花粉 Trichosanthis Radix 4.0
貝母 Fritillariae Thunbergii Bulbus 4.0
白芷 Angelicae Dahuricae Radix 4.0
防風 Saposhnikoviae Radix 2.8
角刺 Gleditsiae Spina 2.0
赤芍藥 Paeoniae Radix Rubra 2.0
乳香 Olibanum 2.0
沒藥 Myrrha 2.0
Total Amount 58.8


3. 실험동물의 골관절염 유발

MIA를 이용하여 실험동물의 무릎에 골관절염을 유발하였다. 실험동물인 흰쥐를 디에틸 에테르(diethyl ether)로 마취시키고 멸균된 normal saline (크린조, JW중외제약, 서울, 대한민국)에 MIA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 mg을 전체 용량이 50 μl가 되도록 하여 29 gauge 인슐린 주사기(성심메디칼, 경기도, 대한민국)를 사용하여 좌측 무릎의 관절강 내로 주입하였다. MIA를 주입하고 1주 이내에 골관절염 유발로 인한 보행 장애 및 통증 반응을 보이지 않는 실험동물은 배제하였고, 4주 동안 경구로 약물을 투여한 후 변화를 관찰하고 실험동물을 ether로 흡입 마취 시켜 희생하였다.

4. 실험군의 분리와 약물 투여

실험군은 흰쥐를 무작위로 8마리씩 나누어 Normal군, OA군, Indomethacin군, Low군 및 High군의 총 다섯 군으로 분리하였다. OA군, Indomethacin군, Low군 및 High군에는 흰쥐의 좌측 무릎의 관절강 내에 MIA를 주입하여 골관절염을 유도하였으며, Normal군에는 동일한 방식과 용량으로 멸균 normal saline (크린조, JW중외제약, 서울, 대한민국)을 주입하였다.

이후 Normal군, OA군에는 증류수 2 ml을 경구 투여하였고, Indomethacin군에는 indomethacin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 2 mg/kg의 농도로 2 ml 음용수에 녹여 경구 투여하였다. SHG 투여량 결정은 70 kg 성인이 하루에 SHG 2첩(117.6 g)을 복용한다고 가정했을 때, 체중 비례로 환산하면 kg 당 1,680 mg의 SHG를 복용한 것이 된다. 이를 흰쥐에 적용하여, Low군에는 SHG를 흰쥐의 체중 kg 당 2 mg, High군에는 SHG를 흰쥐의 체중 kg 당 4 mg을 각각 2 ml 음용수에 녹여 경구 투여하였다.

전체 실험기간 동안 사료와 무균 음수는 모든 군에서 자유 섭취할 수 있도록 하였고, 골관절염 유발 후, 증류수 혹은 약물의 경구 투여는 4주 동안 매일 1회 같은 시각(오전 10시경)에 시행되었다.

5. 체중측정

실험 동안 매일 오전 약물의 경구 투여 직전에 실험동물의 체중을 측정하였고, 실험 종료일에는 부검 직전에 체중을 측정하였다.

6. 관절 연골의 육안적 관찰

실험동물의 좌측 대퇴골(femur)의 원위단과 경골(tibia)의 근위단의 무릎 연골 주변을 깨끗이 정리하여 관절 연골 표면의 상태를 육안으로 관찰한 후, 디지털 카메라를 사용하여 사진 촬영하였다.

7. 관절 연골의 조직학적 검사

1) Hematoxylin-Eosin 염색 관찰: 각 실험군의 흰쥐에서 채취한 경골의 근위단 부위 조직을 중성 formalin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 고정한 후, paraffin section을 하였다. 경골 연골에 대하여 수직 방향으로 두께 8 μm 조직 block을 얻은 후 hematoxylin (BBC Biochemical, Washington, USA)과 eosin (Junsei Chemical Co. Tokyo, Japan)을 이용하여 Hematoxylin-Eosin (H&E) 염색을 시행하였으며, 무릎 연골세포 및 세포외기질(extracelluar matrix, ECM)의 변화에 주목하여 현미경 하에서 조직학적 변화를 관찰하였다.

2) 관절 연골의 두께 측정: 실험에 사용된 흰쥐의 무릎관절 연골 두께 변화를 측정하기 위해 H&E 염색을 시행한 후 촬영하였다. 촬영 후 얻은 영상에 대한 분석을 통해 연골 정중앙 부위의 두께를 측정하였다. 단, 무릎관절 연골 두께는 골 피질선 및 연골의 표면 경계가 명확한 부위에서 연골 표면에 수직방향으로 종단면으로부터 측정하였다.

3) Safranin-O 염색 관찰: 각 실험군의 흰쥐에서 채취한 연골 조직 block에 deparaffin 및 함수과정을 거친 후, hematoxylin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액에 약 10분간 염색하고 세척하였다. 이후, 0.02% fast green FCF (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액으로 5분 동안 염색하고 0.1% acetic acid 용액(삼전화학, 경기도, 대한민국)에 15초간 반응시킨 후, 0.1% safranin-O (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액에 5분 동안 염색하였다. 이와 같은 과정 후, 5∼10분 정도 충분히 세척하고 관절 연골의 횡단면을 촬영하여 proteoglycan 변성 정도를 살펴보았다.

8. 관절 연골의 면역조직화학염색

면역조직화학염색은 자유부유법(free-floating)16)을 사용하여 시행되었으며, 염색에 사용된 primary antibody는 anti-TNF-α (AB6671, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; ABcam, Cambridge, UK), anti-IL-1β (SC52012, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; Santacruz, TX, USA), anti-IL-6 (SC28343, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; Santacruz, Dallas, TX, USA), anti-MMP-13 (SC-101564, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; Santacruz, Dallas, TX, USA), anti-GAGs (MABT819, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), anti-TIMP-1 (SC-21734, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; Santacruz, Dallas, TX, USA)을 사용하였다.

일련의 처리 과정을 거친 연골조직은 Triton X-100 (Amresco, Solon, ME, USA)와 Phosphate buffer saline (PBS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 혼합한 용액을 이용하여 희석한 후 4℃에서 12시간 동안 반응시킨다. 이후, 조직을 PBS로 씻어내고, abidin-biotin immunoperoxidase의 방법(ABC Vectastain kit)을 기준으로 1시간씩 반응시킨다. 면역반응 결과의 정량화를 위해 현미경을 사용하여 일정하게 설정된 동일 면적 내의 면역 양성반응 세포의 수를 측정하였고, 이를 수치화하였다.

9. 혈액학적 검사

SHG를 경구 투여한 후 혈액학적 검사를 시행하여 변화를 관찰하였다. SHG를 투여한 다음 날 흰쥐를 CO2로 마취시킨 후 복대정맥에서 채혈한 전혈 일부를 EDTA로 항응고 처리한 후, 혈구자동측정기(Hemavet, Drew Scientific Co, Oxford, CT, USA)를 이용하여 white blood cell (WBC), red blood cell (RBC), hemoglobin, hematocrit (HCT), platelet, mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH) 및 mean cell hemoglobin concentration (MCHC)을 측정하였다.

10. 혈액생화학적 검사

SHG를 경구 투여한 후 혈액생화학적 검사를 시행하여 변화를 관찰하였다. 채혈을 통해 얻은 흰쥐의 전혈 일부를 원심분리기(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 15분간 3,000 rpm으로 원심분리한 후 혈청을 얻어 혈청 자동분석기(Hitachi 7060, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 total protein, albumin, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatinine, blood urea nitrogen (BUN), total cholesterol, triglyceride 및 glucose를 측정하였다.

11. 간과 신장의 해부조직학적 변화

4주 동안 SHG를 투여한 후 각 실험군의 흰쥐로부터 간(liver)과 신장(kidney)을 적출하여 형태적인 변화 관찰 및 H&E 염색을 통한 해부조직학적 변화와 병변의 유무를 관찰하였다.

12. 통계학적 분석

측정된 모든 자료는 Analysis of variance (ANOVA)을 통해 유의성 여부를 확인한 뒤, Dunnett’s multiple comparison test로 사후 검증하였으며, p<0.01과 p<0.05의 유의수준으로 검증하였다. 모든 값의 수치는 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였다.

통계분석에는 SPSS Version 26.0 (IBM, SPSS Inc. Armonk, NY, USA)이 사용되었다.

결 과

1. 체중의 변화

총 4주 동안의 약물 투여 기간 중 모든 실험군에서 체중이 점차 증가하였는데 실험 개시 당시 각 군 별 흰쥐의 평균 체중은 Normal군, OA군, Indomethacin군, Low 및 High군에서 각각 258.5±3.5 g, 258.7±6.4 g, 259.2±2.9 g, 262.6±4.0 g 및 261.8±5.5 g이었으며, 4주 후 마지막으로 측정된 체중은 327.3± 10.2 g, 329.4±11.4 g, 326.6±8.1 g, 327.5±8.6 g 및 325.2±9.1 g으로 측정되어 각 실험군 사이에 유의성 있는 차이는 발견되지 않았다(Table 2).

Body weight changes of rats for 4 weeks

Group 0 week 1 week 2 weeks 3 weeks 4 weeks
Normal 258.5±3.5 279.0±7.2 287.9±8.8 312.6±11.7 327.3±10.2
OA 258.7±6.4 275.7±5.6 289.3±5.6 312.9±6.4 329.4±11.4
Indomethacin 259.2±2.9 277.5±4.6 290.4±3.7 311.7±12.0 326.6±8.1
Low 262.6±4.0 274.7±5.6 289.4±6.4 310.8±6.9 327.5±8.6
High 261.8±5.5 274.8±5.2 291.0±5.8 311.9±10.7 325.2±9.1

Data represent the mean±standard deviation.

Normal : normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration), OA : MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration), Indomethacin : MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration), Low : MIA (injection at left knee)+2,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration), High : MIA (injection at left knee)+4,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).



2. 관절 연골의 육안적 변화

4주 동안의 약물 투여 후 흰쥐의 무릎관절 내 연골을 육안 관찰하였다. Normal군의 경우 대퇴골(femur)과 경골(tibia)의 관절 연골 표면은 매끈하고 윤기가 있는 상태로, 골극 형성(osteophyte formation)이나 연골 표면 소실 등의 변화는 관찰되지 않았다. 반면에, OA군의 경우는 연골 표면이 매끈하지 못하고 거친 양상의 형태로 변형되었으며, 윤기가 감소하였다. 또한, 국소적으로 연골이 불규칙한 형태 혹은 선상으로 파괴되고, 작은 골극이 형성된 곳도 관찰되었다. Low군과 High군의 경우에도 Normal군과는 다른 연골 표면의 변화가 관찰되었으나 OA군에 비해서는 상대적으로 완화된 양상을 확인하였다(Fig. 1, 2).

Fig. 1. Comparisons of gross appearance of femur plateau in the rats. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water(oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 2. Comparisons of gross appearance of tibial plateau in the rats. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

3. 관절 연골의 조직학적 검사

1) 해부조직학적 변화: 모든 실험군의 무릎관절 연골 조직을 적출하여 H&E 염색을 시행하였다. 각 군의 조직학적 변화를 살펴본 결과, Normal군은 정상 연골 조직 및 연골세포의 모습이 나타났다. 반면에, OA군의 경우는 연골의 파괴가 국소적으로 진행되어 연골 부위의 두께가 Normal군에 비해 현저히 감소되었고, 연골하 골조직의 형성이 관찰되었다. Low군과 High군의 경우에는 관절 연골의 변성이 관찰되었으나 OA군에 비해 상대적으로 보존된 것을 알 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. The histological analyses of cartilage and bone changes in the rats. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

2) 연골의 두께 변화: 흰쥐의 무릎관절의 연골 정중앙부를 촬영하여 영상 분석을 시행하였다. 각 군의 연골의 두께를 측정하여 비교한 결과, 연골의 평균 두께는 Normal군은 259.2±4.3 μm, OA군은 123.2±13.9 μm, Indomethacin군은 201.2±7.6 μm, Low군은 138.5±9.8 μm, High군은 151.5±7.1 μm로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실험군이 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Low군의 연골 두께는 유의성 있게 보존되었고(p<0.05), Indomethacin군과 High군 역시 연골 두께가 유의성 있게 보존되었다(p<0.01). Indomethacin군의 연골 두께는 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 보존되었다(p<0.01). 또한, High군이 Low군에 비해 상대적으로 높은 수치의 평균 연골 두께의 회복이 유의성 있게 관찰되었다(p<0.01) (Fig. 4).

Fig. 4. Quantitative assessment of cartilage thickness in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. *p<0.05, **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. $$p<0.01 compared with Low group. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

3) 연골의 변화: Sulfated proteoglycan의 활발한 합성을 의미하는 safranin-O 염색의 양성반응은 Normal군의 정상소견의 연골증식영역에서 나타났고 OA군에서는 골관절염이 유도된 면에서 남아있는 연골증식영역에서만 관찰되었다. Indomethacin군, Low군 및 High군의 경우에는 OA군에 비해 상대적으로 회복된 양상을 나타내었다(Fig. 5).

Fig. 5. Articular cartilage of the rats knee with safranin-O staining. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

4. 관절 연골의 면역조직화학염색

1) Tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서의 TNF-α는 Normal군은 19.8±2.4 cells/120,000 μm2로 미약하게 발현되었으나, OA군은 90.3±6.7 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 49.5±4.0 cells/120,000 μm2, Low군은 80.5±9.0 cells/120,000 μm2, High군은 72.6± 9.2 cells/120,000 μm2로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실F험군이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Low군의 TNF-α의 발현은 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), Indomethacin군과 High군 역시 TNF-α의 발현이 유의성 있게 감소하였다 p<0.01). Indomethacin군의 TNF-α의 발현은 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). 단, Low군과 High군 사이에는 유의성 있는 차이가 없었다(Fig. 6, 7).

Fig. 6. Representative photographs of TNF-α immunoactivities of articular cartilage in the rats. TNF-α: tumor necrosis factor-α; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 7. Quantitative assessment of TNF-α immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. *p<0.05, **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. TNF-α, tumor necrosis factor-α, Normal : normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

2) Interleukin-1β (IL-1β)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서의 IL-1β는 Normal군은 19.6±2.1 cells/120,000 μm2로 미약하게 발현되었으나, OA군은 70±6.5 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 39.0±6.8 cells/120,000 μm2, Low군은 60.8±7.1 cells/120,000 μm2, High군은 52.5±3.7 cells/120,000 μm2로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실험군이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Low군의 IL-1β의 발현은 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), Indomethacin군과 High군 역시 IL-1β의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). Indomethacin군의 IL-1β의 발현은 Low군과 High군에 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). 또한, High군이 Low군에 비해 IL-1β의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.05) (Fig. 8, 9).

Fig. 8. Representative photographs of IL-1β immunoactivities of articular cartilage in the rats. IL-1β, interleukin-1β; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 9. Quantitative assessment of IL-1β immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. *p<0.05, **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. p<0.05 compared with Low group. IL-1β, interleukin-1β, Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration), OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

3) Interleukin–6 (IL-6)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서의 IL-6은 Normal군은 16.8±3.5 cells/120,000 μm2로 미약하게 발현되었으나, OA군은 64.4±6.4 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 39.3±3.8 cells/120,000 μm2, Low군은 55.0±6.7 cells/120,000 μm2, High군은 49.2±7.5 cells/120,000 μm2로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실험군이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Low군의 IL-6의 발현은 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), Indomethacin군과 High군 역시 IL-6의 발현은 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). Indomethacin군의 IL-6의 발현은 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). 단, Low군과 High군 사이에는 유의성 있는 차이가 없었다(Fig. 10. 11).

Fig. 10. Representative photographs of IL-6 immunoactivities of articular cartilage in the rats. IL-6, interleukin-6; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+ distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 11. Quantitative assessment of IL-6 immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. #p<0.05, ##p<0.01 compared with Normal group. *p<0.05, **p<0.01 compared with OA group. p<0.05, ††p<0.01 compared with Indomethacin group. IL-6, interleukin-6; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

4) Matrix metalloproteinase-13 (MMP-13)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서 MMP-13은 Normal군은 20.5±1.9 cells/120,000 μm2로 미약하게 발현되었으나, OA군은 68.5±4.7 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 38.4±6.7 cells/120,000 μm, Low군은 60.8±6.7 cells/120,000 μm2, High군은 54.7±5.7 cells/120,000 μm2로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실험군이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Low군의 MMP-13의 발현은 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), Indomethacin군과 High군 역시 MMP-13의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). Indomethacin군의 MMP-13의 발현은 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 감소하였다(p<0.01). 단, Low군과 High군 사이에는 유의성 있는 차이가 없었다(Fig. 12, 13).

Fig. 12. Representative photographs of MMP-13 immunoactivities of articular cartilage in the rats. MMP-13, matrix metalloproteinase-13; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 13. Quantitative assessment of MMP-13 immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. *p<0.05, **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. MMP-13, matrix metalloproteinase-13; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

5) Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서의 TIMP-1는 Normal군은 4.4±1.4 cells/120,000 μm2로 미약하게 발현되었으나, OA군은 10.2±1.1 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 37.5±3.4 cells/120,000 μm2, Low군은 17.4±2.6 cells/120,000 μm2, High군은 20.1±1.9 cells/120,000 μm2로 측정되어 Normal군에 비해 모든 실험군이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 반면, OA군에 비해 Indomethacin군, Low군, High군의 TIMP-1의 발현은 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). Indomethacin군의 TIMP-1의 발현은 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 또한, High군이 Low군에 비해 TIMP-1의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p<0.05) (Fig. 14, 15).

Fig. 14. Representative photographs of TIMP-1 immunoactivities of articular cartilage in the rats. TIMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinase-1; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 15. Quantitative assessment of TIMP-1 immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. p<0.05 compared with Low group. TIMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinase-1; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

6) Glycosaminoglycans (GAGs)의 발현 변화: 흰쥐의 무릎관절 내 연골에서의 GAGs는 Normal군은 28.3±1.7 cells/120,000 μm2로 발현이 관찰되었으나, OA군은 10.9±1.9 cells/120,000 μm2, Indomethacin군은 44.7±5.8 cells/120,000 μm2, Low군은 28.8± 4.7 cells/120,000 μm2, High군은 37.1±3.9 cells/120,000 μm2로 측정되었다. Normal군에 비해 OA군의 GAGs의 발현은 유의성 있게 감소하였고(p<0.01), Indomethacin군, High군의 GAGs의 발현은 유의성 있게 증가하였으며(p<0.01), Low군 역시 GAGs의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p<0.05). OA군에 비해 Indomethacin군, Low군, High군 모두 GAGs의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). Indomethacin군의 GAGs의 발현은 Low군과 High군에 비해 유의성 있게 증가하였다(p<0.01). 또한, High군이 Low군에 비해 GAGs의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p< 0.05) (Fig. 16, 17).

Fig. 16. Representative photographs of GAGs immunoactivities of articular cartilage in the rats. GAGs, Glycosaminoglycans; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

Fig. 17. Quantitative assessment of GAGs immunohistochemistry in the rats. Data represent the mean±standard deviation. Data were checked for significance using ANOVA and Dunnett’s multiple comparison test to verify the significance levels of p<0.05 and p<0.01, respectively. ##p<0.01 compared with Normal group. **p<0.01 compared with OA group. ††p<0.01 compared with Indomethacin group. p<0.05 compared with Low group. GAGs, glycosaminoglycans; Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

5. 혈액학적 검사

혈액학적 검사 결과, 각 실험군들의 혈액학적 지표들은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 3).

The Hematological Values of Rats

Index Normal OA Indomethacin Low High
WBC (103/μl) 4.52±0.33 4.59±0.34 4.83±0.19 4.45±0.31 4.54±0.37
RBC (106/μl) 7.80±0.31 7.62±0.77 7.69±0.33 7.37±0.59 7.50±0.36
Hemoglobin (g/dl) 10.36±0.26 9.91±0.63 10.10±0.33 9.99±0.62 10.06±0.33
HCT (%) 29.61±0.91 30.03±1.14 30.54±0.81 29.50±1.17 30.09±1.00
Platelet (103/μl) 933.51±7.35 935.63±8.86 927.32±7.69 928.42±8.14 926.81±11.65
MCV (fl) 39.47±1.86 40.16±2.05 41.39±2.28 38.96±1.96 40.51±1.96
MCH (pg) 11.70±1.08 12.42±1.33 12.16±1.43 11.65±0.82 12.03±1.07
MCHC (g/dl) 29.84±1.84 29.38±1.39 30.28±0.73 29.63±1.15 30.39±1.21

The values represent the mean±standard deviation.

HCT : hematocrit, MCV : mean cell volume, MCH : mean cell hemoglobin, MCHC : mean cell hemoglobin concentration, Normal : normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration), OA : MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration), Indomethacin : MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration), Low : MIA (injection at left knee)+2,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration), High : MIA(injection at left knee)+4,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).



6. 혈액생화학적 검사

혈액생화학적 검사 결과, 각 실험군들의 혈액생화학적 지표들은 모든 군에서 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 4).

The serum biochemical values of rats

Index Normal OA Indomethacin Low High
Total protein (g/dl) 4.93±0.27 4.86±0.18 5.03±0.13 5.03±0.18 5.14±0.18
Albumin (g/dl) 1.49±0.05 1.52±0.06 1.52±0.04 1.54±0.05 1.49±0.04
Total bilirubin (mg/dl) 0.14±0.01 0.15±0.01 0.15±0.01 0.15±0.01 0.15±0.01
ALP (IU/L) 39.22±1.58 40.81±1.59 39.12±1.28 40.08±2.06 40.37±1.13
AST (IU/L) 60.08±3.15 60.96±3.11 59.45±2.96 60.7±2.96 59.31±3.68
ALT (IU/L) 19.57±0.62 19.75±0.6 20.14±0.78 20.52±0.76 19.86±1.33
Creatinine (mg/dl) 0.39±0.02 0.39±0.01 0.4±0.03 0.4±0.01 0.41±0.02
BUN (mg/dL) 17.04±0.79 16.8±0.43 17.32±0.67 17.15±0.84 16.69±0.73
Cholesterol (mg/dl) 146.31±5.48 145.31±7.85 147.61±9.39 142.3±5.72 145.36±6.74
Triglyceride (mg/dl) 63.24±3.66 64.33±3.21 65.55±3.07 65.42±3.3 64.75±2.02
Glucose (mg/L) 5.04±0.36 4.99±0.23 5.09±0.27 4.86±0.21 5.13±0.28

The values represent the mean±standard deviation.

ALP : alkaline phosphatase, AST : aspartate aminotransferase, ALT : alanine aminotransferase, BUN : blood urea nitrogen, Normal : normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration), OA : MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration), Indomethacin : MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration), Low : MIA (injection at left knee)+2,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration), High : MIA(injection at left knee)+4,000 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).



7. 간과 신장의 해부조직학적 변화

1) 간의 해부조직학적 변화: 실험에 사용된 흰쥐의 간을 적출하고, H&E 염색을 통하여 간 조직을 관찰하였다. Normal군에서는 간 조직의 간문맥 및 실질의 구조를 정상적으로 유지하고 있었고, 정상적인 조직학적 소견을 보였다. OA군, Indomethacin군, Low 및 High군의 경우에도 간 조직의 염증세포 침윤, 간세포의 괴사 및 지방변성 등의 변화를 보이지 않았으며, Normal군과 비교하여 유의성 있는 차이는 없었다(Fig. 18).

Fig. 18. Hematoxylin & Eosin stained liver tissues from rats. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).

2) 신장의 해부조직학적 변화: 실험에 사용된 흰쥐의 신장을 적출하고, H&E 염색을 통하여 신장 조직을 관찰하였다. 모든 실험군에서 정상적인 사구체(glomerulus), 곡세뇨관(convoluted tubule) 및 상피세포가 관찰되었으며, OA군, Indomethacin군, Low군 및 High군의 경우에도 세포질이 조밀하였고, 세뇨관의 표피 박리, 팽창, 혹은 세포사멸 등의 변화도 발견되지 않았다. 각 군 사이에 유의성있는 차이는 없었다(Fig. 19).

Fig. 19. Hematoxylin & Eosin stained kidney tissues from rats. Normal, normal saline (injection at left knee)+distilled water (oral administration); OA, MIA (injection at left knee)+distilled water (oral administration); Indomethacin, MIA (injection at left knee)+indomethacin 2 mg/kg (oral administration); Low, MIA (injection at left knee)+2 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration); High, MIA (injection at left knee)+4 mg/kg of Sunbanghwalmyung-eum gamibang (oral administration).
고 찰

仙方活命飮은 본래 陳自明의 ≪婦人良方校注補遺≫17)에 처음 제시된 방제로, 이후 李梴의 ≪醫學入門≫18)에서 大黃이 가미되어 각종 염증성 질환의 치료를 위해 활용되어 왔고, ≪東醫寶鑑≫19)에서는 “一切癰疽毒腫未成者內消已成者 潰排膿止痛消毒之聖藥也.”이라 하여 癰疽疾患에 많이 사용되었다. 현대에는 李鳳敎의 ≪症狀鑑別治療≫20)에서 淸熱解毒, 消腫止痛의 治法으로 치료해야 할 膝腫痛에 활용할 수 있음을 설명하였다. 이 밖에도 중이염21), 급성 부비동염22), 봉와직염 및 봉와직염 변연절제술 시행환자에 대한 효과23) 등이 보고되어 있으나, 골관절염에 대해서는 실제 임상에서의 처방 활용 빈도에 비해 관련된 연구 보고를 찾아보기 힘들었다.

본 실험 연구의 SHG는 ≪證脈•方藥合編≫15)에 제시된 처방을 기준으로 蒲公英 (Taraxaci Herba)과 牛膝 (Achyranthis Radix)을 추가하고 穿山甲 (Manitis Squama)을 제외하여, 金銀花, 當歸尾, 陳皮, 牛膝, 蒲公英, 甘草, 天花粉, 貝母, 白芷, 防風, 皂角刺, 赤芍藥, 乳香, 沒藥으로 구성되어 있다. 원 처방의 穿山甲은 活血通經, 下乳 및 消腫排膿24)의 효능이 있으나 멸종 위기에 처한 야생 동ㆍ식물종의 국제거래에 관한 협약(CITES)25)에 의해 본 실험의 약물 구성에서는 제외하였다. 본 연구에서는 임상에서 주로 염증성 질환이나 농양 혹은 종양에 사용해왔던 仙方活命飮을 골관절염 환자에게 투여했을 시에 기대되는 항염증 효과 여부에 대해 확인하기 위해 MIA로 유발한 골관절염 흰쥐 모델을 이용하여 연구를 시행하였다.

본 연구는 골관절염을 유발하지 않고 증류수의 경구 투여를 시행한 정상군(Normal군), MIA로 골관절염을 유발하고 증류수의 경구 투여를 시행한 대조군(OA군), MIA로 골관절염을 유발하고 Indomethacin의 경구 투여를 시행한 양성대조군(Indomethacin군), MIA로 골관절염 유발하고 저농도 SHG의 경구 투여를 시행한 군(Low군) 및 MIA로 골관절염을 유발하고 고농도 SHG의 경구 투여를 시행한 군(High군) 등 총 5개의 군으로 나누어 4주 동안 시행하였다. 여기에서 사용한 Indomethacin은 비스테로이드성 소염 진통제(NSAIDs) 계열의 약물로서 prostaglandin을 생성하는 Cyclooxygenase (COX)를 억제하는 기전을 통해 소염, 해열 및 진통 등의 작용을 하여 골관절염, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염 등의 질환에 사용되는 약물이다.

MIA를 통하여 관절염을 유발시킨 후 4주 동안의 실험을 종료하면서 무릎 관절을 구성하고 있는 대퇴골과 경골의 관절 연골 표면을 육안으로 관찰한 결과, Normal군은 연골 표면이 윤기가 있고 매끈한 상태이며, 표면 소실이나 골극 형성 등의 변화가 없었으나, OA군에서는 연골 표면이 거칠고, 윤기가 감소한 상태로 변화되었으며, 국소적으로 연골의 파괴 및 작은 골극이 관찰되었다. 반면, Indomethacin군, Low군 및 High군에서는 OA군에 비해 상대적으로 연골 표면이 보전되어 있는 양상을 관찰할 수 있었다.

병리조직학적 검사에서의 H&E 염색은 전반적 조직 구조를 확인하기 위한 염색 기술로 악성 세포를 그렇지 않은 세포와 구별할 수 있도록 도와주어, 조직 진단에 훌륭한 도구로 활용되며, 호염기성의 hematoxylin과 호산성의 eosin이 세포질과 핵 및 proteoglycan 등을 염색하게 된다26). 본 실험에서는 무릎 관절의 연골 및 활막 조직의 손상을 확인하기 위해 시행되었으며, Normal군에서 관찰되는 정상 연골조직과 연골세포와 달리, OA군에서는 연골 부위의 두께가 현저히 감소하였고, 연골하 골조직 형성 또한 관찰되었다. Low군과 High군에서는 OA군에 비해 상대적으로 관절 연골이 보존되어 있는 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 무릎 관절 내 연골의 두께는 Normal군에 비해 OA군에서 확연한 감소를 보였고, Indomethacin군, Low군 및 High군에서는 연골 두께가 OA군에 비해서 보존된 양상을 보였으며, 특히, SHG를 경구 투여한 실험군 사이에서 고농도 군이 저농도 군에 비해 조금 더 유의한 효과를 보였다.

병리조직학적 검사에서의 safranin-O 염색은 연골에 분포하는 proteoglycan의 농도 변화를 측정하기 위하여 시행되었다. 염기성을 띤 safranin-O 용액은 연골 기질 내에서 음전하를 가지는 proteoglycan의 농도에 따라 연골 조직을 붉은색이나 주황색으로 염색하게 된다. Normal군에서는 정상 소견의 연골증식영역에서 나타났고, OA군에서는 남아있는 연골증식영역에서만 나타났으며, Low군과 High군에서는 연골증식영역의 proteoglycan의 형태가 OA군에 비해 비교적 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다.

골관절염의 발병에 있어서 중요한 요소는 염증과 관련한 cytokine으로 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-15, IL-17 및 IL-18 등이 있다. 골관절염은 이러한 cytokine 체계에서 염증과 항염증 cytokine 사이의 조절 장애로 인한 대사 불균형으로 인해 유발된다27).

TNF-α는 proteoglycan과 type Ⅱ collagen의 구성 요소인 연골세포의 합성을 저해하며, 이와 동시에 연골세포에서는 MMP-1, MMP-3, MMP-13 및 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-4 (ADAMTS-4)를 생성한다. 또한, TNF-α와 IL-1β는 cytokine-inducible Nitric oxide synthases (iNOS), COX-2 및 PGE2의 합성을 유도한다27). 본 실험에서 TNF-α는 OA군에 비해 Low군과 High군에서 모두 유의성 있게 감소했다. 단, SHG의 용량에 의한 효과 차이는 명확하지 않았다. 이를 통해, SHG가 TNF-α의 발현을 억제하여 연골세포의 합성 저해를 막고, MMPs, iNOS, COX-2 및 PGE2의 합성률을 낮추는 기전을 통해 골관절염의 발생을 막을 수 있을 것으로 사료된다.

Interleukin-1β (IL-1β)는 독립적 혹은 다른 중개 물질들과 함께 관절의 연골이나 기타 구성 요소들에 대해서 염증 반응을 유도한다. 골관절염 환자는 윤활액, 활막, 연골, 연골하골층에서 IL-1β의 농도가 증가하게 된다28). 본 실험에서 IL-1β는 OA군에 비해 Low군과 High군에서 모두 유의성 있게 감소했다. 또한, SHG가 고농도일수록 IL-1β의 발현을 유의성 있게 감소시켰다. 이를 통해, SHG가 IL-1β의 발현을 억제하여 MMPs의 합성과 연골세포의 노화 및 자멸사를 막고, ROS의 생성을 억제하는 등의 항염증, 항산화 작용을 통해 골관절염의 발생을 막을 수 있을 것으로 사료된다.

Interleukin-6 (IL-6)는 면역 체계를 활성화하고, 염증반응을 강화시키는 역할의 cytokine으로 여겨지며 IL-6의 관절 연골에 대한 효과는 다른 cytokine들과 크게 구별되지 않는다. 본 실험에서 IL-6는 OA군에 비해 Low군과 High군에서 모두 유의성 있게 감소했다. 단, SHG의 용량에 의한 효과 차이는 명확하지 않았다. 이를 통해, SHG가 IL-6의 발현을 억제하여 type Ⅱ collagne의 생성을 원활하게 하고, MMPs의 합성을 억제하는 등의 효과로 골관절염의 발생을 막을 수 있을 것으로 사료된다.

결론적으로, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 염증 cytokine은 단계적 효과를 보이는데, 노화나 연골세포의 세포자멸사를 유도할 뿐만 아니라, ECM 구성의 핵심인 proteglycan, aggrecan 및 type Ⅱ collagen 등의 합성을 감소시킨다. 또한, 연골의 합성을 저해하는 MMPs 군과 같은 효소의 합성과 분비를 촉진하고, 염증 cytokine을 더욱 활성화시켜 PGE2, COX-2, phospholipase A2, NO 및 free radical 등이 과도하게 생성되도록 한다. 즉, 염증 cytokine은 세포를 자극하여 또 다른 염증 cytokine을 생성하게 되며, 이를 통해, 염증 과정은 자가분비, 곁분비 및 자기 추진 효과의 단계적인 효과를 가지는 것을 알 수 있다27). SHG가 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 효과적으로 억제하여 위와 같은 과정을 중재하여 관절의 염증 반응을 조절할 수 있고, 특히 IL-1β와 관련한 기전에서는 SHG의 농도 의존적 효과가 있는 것으로 사료된다.

MMPs는 생명 유지에 필요한 조절 단백으로, 주로 IL-1β에 의해 유도되며, ECM의 속하는 대부분의 구성물을 분해할 수 있다29). 특히, MMP-13은 기질 단백 분해 효소로 주로 type Ⅱ collagen의 분해를 활성화하여 관절 연골을 손상시키는 기전과 관련이 있다. 본 실험에서 MMP-13은 OA군에 비해 Low군과 High군에서 모두 유의성 있게 감소했다. 단, SHG의 용량에 의한 효과 차이는 명확하지 않았다. 이를 통해, SHG가 MMP-13의 발현을 억제하여 type Ⅱ collagen의 분해를 억제하여 관절 연골을 보호할 수 있을 것으로 사료된다.

Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs)는 길항작용으로 MMPs의 분비를 억제하는데, 두 물질의 균형을 바탕으로 관절 연골세포의 이화 혹은 동화작용을 조절한다30). 모든 MMPs는 활성화되면 TIMPs에 의해 억제되며, 그 중에서도 TIMP-1은 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다31). 본 실험에서 TIMP-1은 OA군에 비해 Low군과 High군에서 모두 유의성 있게 증가되었다. 또한, SHG가 고농도일수록 TIMP-1의 발현을 유의성 있게 상승시켰다. 이를 통해, SHG는 TIMP-1의 발현을 촉진하여 MMPs의 기능을 길항작용하여 관절을 보호하고 염증 반응을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

Glycosaminoglycans (GAGs)는 관절 연골의 콜라겐을 보호하고, proteoglycan을 만들어 연골 성분을 구성하게 하는 것으로 알려져 있다32). 본 실험에서 GAGs는 OA군에 비해 Low군과 High군 모두에서 유의성 있게 증가되었다. 또한, SHG가 상대적으로 고농도일수록 GAGs의 발현을 유의성 있게 상승시켰다. 이를 통해, SHG는 GAGs의 발현을 촉진하여 콜라겐 성분을 보호하고, proteoglycan의 분비를 유지하여 연골을 보호할 것으로 사료된다.

SHG의 투약 안전성을 판단하고자 실험이 종료된 후 혈액학적 및 혈액생화학적 검사를 시행하였고, 유의한 이상 소견은 없었다. 또한, 간과 신장 조직을 관찰한 결과 특별한 병적 이상 소견은 없었다.

본 연구 결과를 종합적으로 분석하였을 때, SHG는 염증을 억제하고, MMP-13의 발현을 감소시키며, 연골 보호 효과가 있음을 알 수 있다.

다만, 본 실험에서 아쉬운 점은 SHG가 대부분의 지표에서 유효한 효과를 보였으나, Indomethacin군과의 비교 시에 유의성이 높지 않았고, SHG의 농도 의존성 효과가 일부 지표에서만 확인된 것이다. 단, 퇴행성 질환인 골관절염의 임상적 특성상 장기적인 치료가 필요한 질병이기에 Indomethacin 등의 NSAIDs 약물을 장기 복용 시에 부작용 발생이 우려되는데, 이에 비해 SHG는 투약 안전성에 대한 실험 결과를 바탕으로 장기 투약 관점에서 상대적인 안전성이 높을 것으로 기대된다. 또한, 본 실험에서 High군이 Low군에 비해 모두 좋은 효과를 보였는데, 만약, 충분한 고농도의 SHG를 투여했다면 Indomethacin군과 유사한 수준의 효과를 보였을 것으로 기대되는 바, 이와 관련하여 농도에 따른 효과를 명확히 확인하기 위해 더 세분화된 실험군을 설정하지 못한 것이 연구의 한계점으로 볼 수 있겠다. 이러한 점을 보완하여, 장기적인 동물 실험에 대한 연구를 선행한 후, 인체를 대상으로 한 임상 실험을 설계하여 대규모의 연구를 통한 효과 입증에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결 론

본 연구에서 MIA로 유발한 골관절염 rat 모델에 仙方活命飮 加味方을 4주 동안 경구 투여하여 무릎관절의 연골에 대해 육안적ㆍ조직학적 변화를 살펴보고, 항염증, 연골 손상 관련 인자 및 안전성을 관찰한 결과, 아래와 같은 결론을 얻었다.

1. 仙方活命飮 加味方은 무릎관절 연골의 변성을 억제하고 손상을 막으며, 두께를 보존하였다.

2. 仙方活命飮 加味方은 염증성 cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6)의 발현을 유의성 있게 감소시켰다.

3. 仙方活命飮 加味方 연골 손상 인자인 MMP-13의 발현을 억제하고, 연골 보호 인자인 TIMP-1 및 GAGs의 발현을 유의성 있게 증가시켰다.

4. 仙方活命飮 加味方의 안전성 확인을 위해 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 간 조직 및 신장 조직 검사에서 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다.

위의 결과를 종합하면, MIA로 유발된 골관절염 rat 모델에 仙方活命飮 加味方이 항염증 효과, 연골 보호 효과가 있다고 사료된다. 또한 NF-κB의 활성을 억제시켜 염증성 cytokine의 발현을 감소시키는 효과 등은 기존 연구11,12)에 보고된 바 있으며 본 연구에서도 염증성 cytokine의 발현을 유의미하게 감소시키는 효과가 있어 골관절염에 대한 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

Acknowledgement

None.

Funding

None.

Data availability

The authors can provide upon reasonable request.

Conflicts of interest

저자들은 아무런 이해 상충이 없음을 밝힌다.

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December 2022, 39 (4)
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