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Proteomic Analysis for Neuroprotective Effect of Gastrodia elata Blume in the Substantia Nigra of Mice
천마의 흑질 내 도파민성 신경세포 보호 효과에 대한 단백체학적 분석
Korean J Acupunct 2022;39:142-151
Published online December 27, 2022;  https://doi.org/10.14406/acu.2022.029
© 2022 Society for Meridian and Acupoint.

Chang-Hwan Bae1 , Hee-Young Kim2 , Hanul Lee1 , Ji Eun Seo1 , Dong Hak Yoon3 , Seungtae Kim1 ,2
배창환1ㆍ김희영2ㆍ이한울1ㆍ서지은1ㆍ윤동학3ㆍ김승태1,2

1Department of Korean Medical Science, School of Korean Medicine, Pusan National University,
2Healthy Aging Korean Medical Research Center, Pusan National University,
3KyungHee YDH Oriental Clinic
1부산대학교 한의학전문대학원 한의과학과, 2부산대학교 건강노화한의과학연구센터, 3경희윤동학한의원
Correspondence to: Seungtae Kim
Department of Korean Medical Science, School of Korean Medicine, Pusan National University, 49 Busandaehak-ro, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do 50612, Korea
Tel: +82-51-510-8473, Fax: +82-51-510-8437, E-mail: kimst@pusan.ac.kr
This study was supported by a research grant of the Health Fellowship Foundation.
Received November 24, 2022; Revised December 2, 2022; Accepted December 5, 2022.
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Objectives Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder threatening the quality of life and highly occurred in over 65 years old. Gastrodia elata Blume (GEB), a traditional medicine used for the treatment of headache and convulsion, has been reported to have neuroprotective effect. This study was designed to investigate the neuroprotective effect of GEB and the proteomic changes in the substantia nigra (SN) of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-treated mice.
Methods Male eleven-week-old C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with 30 mg/kg of MPTP at 24-h intervals for 5 days. Two hours after the daily MPTP injection, the mice were orally administered 800 mg/kg of GEB extract, which continued for 7 days beyond the MPTP injections, for a total of 12 consecutive days. Two hours after the final GEB administration, the brain samples were collected, and dopaminergic neuronal death and proteomic changes in the SN were evaluated.
Results GEB prevented the MPTP-induced dopaminergic neuronal death and regulated the expression of 11 proteins including thimet oligopeptidase, T-complex protein 1, glycine tRNA ligase, and pyruvate kinase isozymes M1.
Conclusions GEB prevents MPTP-induced dopaminergic neuronal death by regulating the proteins in the SN.
Keywords: Parkinson’s disease, Gastrodia elata Blume, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, two-dimensional electrophoresis, substantia nigra
서 론

파킨슨병은 떨림, 경직, 서동, 자세 불안정 등의 증상을 보이는 퇴행성 뇌 질환으로, 흑질의 도파민성신경세포 파괴로 인해 선조체의 도파민 농도가 감소되어 증상이 발현되며, 65세 이상에서 급증하는 경향을 보인다1). 파킨슨병의 병리기전은 아직까지 명확하지 않지만, 산화 스트레스(oxidative stress)와 단백질 잘못접힘(protein misfolding)이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 예를 들면 DJ-1은 항산화 기전을 조절하여 흑질의 도파민성신경세포를 보호하고, SNCA 유전자 돌연변이는 알파-시누클레인(alpha-synuclein)의 잘못접힘을 유발한다2,3).

일반적으로 파킨슨병 환자의 증상을 완화하기 위해 도파민 전구체인 레보도파를 투여하는 경우가 많지만, 레보도파를 오래 복용하는 경우 이상운동증 같은 부작용이 발생한다4,5). 그렇기에 레보도파를 사용하기 시작하는 시점을 최대한 늦추기 위해 파킨슨병 발병 초기에 도파민 효현제를 운동증상 개선을 위해 사용하고, 레보도파의 복용량을 낮추기 위해 대사억제제를 병용 투여하는 방법을 시행한다6). 더불어 바이러스 벡터를 이용해 유전자를 조절하거나 glucagon-like peptidase-1 수용체 작용제를 이용하는 새로운 파킨슨병 치료법 임상시험이 진행되고 있으나 현재까지 명확한 결과가 나오지 않은 실정이다7).

천마는 난초과 식물인 Gastrodia elata Blume의 덩이줄기를 쪄서 건조한 것으로, 전통적으로 평간식풍약(平肝息風藥)으로 분류하고 두통, 어지러움, 팔다리의 마비, 어린이의 발작, 경련 및 떨림, 파상풍 등을 치료하는데 사용한다8). 최근 천마가 경련과 염증을 억제 하고9,10), 단백질 잘못접힘과 산화 스트레스를 조절하는 효과가 있다는 연구 결과가 보고되었다11,12). 파킨슨병과 관련된 연구의 경우, 천마가 6-hydroxydopamine으로 유발한 파킨슨병 동물모델에서 레보도파 투여로 인한 떨림을 억제하고13), 천마의 지표물질인 gastrodin이 파킨슨병 실험모델에서 도파민성 신경세포를 보호한다는 보고가 존재한다14,15). 하지만 관련 연구가 그리 많지 않아 파킨슨병에 대한 천마의 작용 기전은 아직까지 명확하게 파악하지 못한 상황이다.

이차원 전기영동(2-dimensional electrophoresis)은 단백질이 가진 전하와 분자량의 차이를 이용하여 단백질을 분리하는 방법으로, 1차원적으로 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)을 하여 단백질을 등전점 기준으로 분리한 후 다시 2차원적으로 전기영동을 실시함으로써 등전점이 같은 단백질을 분자량을 기준으로 분리하는 프로테오믹스 기법이다. 이 기법은 조직 내 단백질별 발현량을 한꺼번에 확인할 수 있기에, 특정 질환 및 약물에 의해 단백질 발현이 변화하는 과정을 파악하고 나아가 약물의 치료 효과 및 독성 파악, 표적 확인, 진단의 생화학적 표지자 탐색 등에 응용할 수 있다. 본 연구는 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)으로 유도한 파킨슨병 생쥐 모델을 이용하여 천마의 흑질 내 도파민성신경세포 보호효과를 확인한 뒤, 이차원 전기영동으로 흑질 내 단백질체 변화를 조사하여 의미 있는 결과를 도출하였기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 천마추출물 제조

전북 무주산 건조 천마(광명당제약, 울산, 한국) 100 g을 약 1 cm3로 절단하여 10배량의 70% 에탄올 용액에 담그고, 15분 간 초음파 처리를 한 후 실온에서 밤새 보관하였다. 상층액을 필터로 거른 후 보관하였고, 남은 천마는 같은 과정을 한 번 더 반복하였다. 두 상층액을 합한 뒤 감압 농축 및 동결 건조를 시행하여 총 수율 5.5%의 건조 천마추출물을 획득하였다.

2. 실험동물

본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 얻은 후 진행되었다. C57BL/6계 수컷 11주령 생쥐(샘타코, 오산, 한국)를 사용하였으며, 실험 1주일 전부터 실험기간 동안 사육실(온도 22±2℃)에서 물과 먹이를 자유로이 섭취하도록 하여 스트레스 및 환경의 변화에 따른 영향인자를 최소화하였다. 총 27마리의 동물을 무작위로 정상군(Saline group), MPTP군(MPTP group), 천마군(MPTP+GEB group)에 각각 9마리씩 배정하였다.

3. 약물 투여 및 체중 측정

정상군은 5일간 1일 1회 같은 시간에 생리식염수 0.1 ml을 복강 내 주입하였고, 나머지 군들은 파킨슨병을 유발하기 위해 30 mg/kg의 MPTP (Sigma, St. Louis, USA)를 5일간 1일 1회 24시간 간격으로 복강 내 주입하였다. MPTP 투여 2시간 후부터 800 mg/kg 용량의 천마추출물을 물에 녹여 24시간 간격으로 12일 간 천마군 생쥐에 경구 투여하였다(Fig. 1A). MPTP 및 천마 투여 직전(day 1), 마지막 MPTP 투여 직전(day 5), 마지막 천마 투여 직전(day 12)에 생쥐의 체중을 측정하였다.

Fig. 1. (A) Experiment schedule. (B) Body weight of mice on day 1, 5, and 12. GEB, Gastrodia eleta Blume; MPTP, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; TH, tyrosine hydroxylase.

4. 면역조직염색화학법

마지막 경구 투여 2시간 뒤, 군당 6마리의 생쥐를 포란액(isoflurane, 중외제약, 서울, 한국)으로 마취시킨 후, phosphate buffered saline (PBS)으로 관류를 하여 체내의 혈액을 모두 제거하고, 바로 4% paraformaldehyde (PFA) 용액을 관류시켜 조직을 고정하고 생쥐의 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌를 24시간 동안 PFA에 담가 완전히 고정하고, 30% sucrose 용액에 담갔다. 뇌가 가라앉은 후 cryotome (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 30 μm의 두께로 절편을 하였고, 흑질 부위의 도파민성신경세포의 파괴 정도를 확인하기 위해 면역조직염색화학법을 실시하였다. 절편을 PBS로 세척한 후 0.3% 과산화수소 용액에 15분간 담그고, 항체의 비특이적 결합을 예방하기 위해 0.5% 염소 혈청에 담근 후 tyrosine hydroxylase (TH; Abcam, ab112, Cambridge, UK) 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석한 용액에 담가 상온에서 밤새 반응시켰다. 절편을 PBS로 세척한 후 Vectastain Elite ABC reagent (Vector Laboratories Inc., PK-6101, Burlingame, USA)에 1시간 동안 반응시킨 후 3,3’-diaminobenzidine으로 5분간 발색하였다. 조직 사진은 Axio Scope A1 microscope (Carl ZEISS, Oberkochen, Germany)와 AxioCam ICc3 camera (Carl ZEISS, Germany)를 이용하여 촬영하였으며, 흑질의 도파민성신경세포 수를 직접 세었다.

5. 이차원 전기영동

1) 시료 준비: 마지막 경구 투여 2시간 뒤, 군당 3마리의 생쥐를 CO2 가스로 안락사한 후 흑질 조직을 적출하고 바로 −80℃ deep freezer에서 실험할 때까지 보관하였다. 단백질 추출을 위해 조직을 단백질 용해 완충용액(7 M urea, 2 M Thiourea, 4% (w/v)3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1% (w/v) dithiothreitol (DTT), 2% (v/v) pharmalyte, 1 mM benzamidine)과 혼합하여 homogenizer로 분쇄한 후 1시간 동안 vortex하고 15℃에서 15,000 rpm으로 원심 분리 후 상층액을 채취하여 시료로 사용하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bradford법으로 확인하였다.

2) 전기영동: 일차 등전점 분리를 위하여 건조된 immoblized pH gradient (IPG) strip을 7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 1% DTT, 1% pharmalyte로 구성된 완충용액에 상온에서 16시간 담근 후, strip당 700 μg의 시료를 가하고 Multiphore II electrophoresis system (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 이용하여 20℃에서 IEF를 실시하였다. IEF 조건은 150 V에서 3,500 V까지의 도달시간을 3시간으로 하였으며, 3,500 V에서 26시간 지속되도록 하여 최종적으로 96 kVh가 되도록 설정하였다. 전기영동을 하기 전 IPG strip을 1% DTT가 포함된 equilibration buffer (50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol에 10분간 담근 직후 2.5% iodoacetamide를 함유한 equilibration buffer에 10분간 더 담갔다. Equilibration이 끝난 strip은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis용 gel에 부착하고 Hoefer DALT 2D system (GE healthcare, Chicago, USA)을 사용해 20℃에서 1.7 kVh가 되도록 한 후 전기영동을 실시하였다. 이차원 전기영동이 완료된 후 gel의 단백질은 coomassie G250으로 염색하였으며, 염색된 단백질 spot들은 PDQuest 소프트웨어(version 7.0; Bio-Rad, Hercules, USA)로 발현량을 측정하였다.

3) 단백질 분석: 단백질 spot을 자른 후, 트립신과 50% acetonitrile, alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 가한 50% acetonitrile/0.1% trifloroacetic acid 용액에 담가 녹이고 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)분석을 실시하였다. Spectra는 Flex Analysis 3.0 소프트웨어(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 사용하여 얻었고, 단백질 분석은 MASCOT 프로그램(http://www.matrixscience.com/)을 사용하였다.

4. 통계

모든 자료는 평균±표준편차로 표시하였고, 통계 분석은 Prism 4 for Windows 프로그램(GraphPad Software, La Jolla, USA)으로 일원분산분석과 Bonferroni 사후 검정을 실시하였으며, p값이 0.05보다 적은 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결 과

1. 천마의 도파민성신셩세포 보호 효과

MPTP 및 천마 투여 직전(day 1), 마지막 MPTP 투여 직전(day 5), 마지막 천마 투여 직전(day 12)에 생쥐의 체중을 측정한 결과, 군간 유의한 체중의 변화는 없었다(Fig. 1B). 천마의 도파민성신경세포 보호효과를 확인하기 위해 면역조직염색화학법을 실행한 결과, MPTP군의 중뇌 흑질 내 도파민성신경세포 수는 정상군에 비해 유의하게 감소하였으나(p<0.001, 70.7±8.6%), 천마군은 MPTP군에 비해 유의하게 증가하였고(p<0.001, 105.9±10.0%) 정상군과 유의한 차이가 없었다(Fig. 2).

Fig. 2. Neuroprotective effect of GEB on dopaminergic neurons in the substantia nigra. GEB prevents MPTP-induced dopaminergic neuronal death in the substantia nigra. Data was presented as mean±standard deviation. ***p< 0.001 vs control group. ###p<0.001 vs MPTP group. GEB, Gastrodia eleta Blume; MPTP, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; TH, tyrosine hydroxylase.

2. 이차원 전기영동

천마의 도파민성신경세포 보호효과와 관련된 단백질을 확인하기 위해 이차원 전기영동을 실시한 결과 총 378개의 단백질이 검출되었고, 이들 중 통계적으로 유의한 변화가 관찰된 것은 총 11종이었다(Fig. 3).

Fig. 3. Protein profiles with two-dimensional electrophoresis. (A) Obtained proteins over different pI ranges. (B) Identified protein spots in gels. Differentially-expressed protein spots are marked with red spots. GEB, Gastrodia eleta Blume; MPTP, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.

3. 단백질 발현량의 변화

MALDI-TOF MS 결과를 MASCOT 프로그램으로 분석한 결과, 11종의 단백질은 gelsolin, glycine tRNA ligase, heat shock cognate 71 kDa protein, isoform 3 of dynamin-1, Isoform M1 of pyruvate kinase, lactoylglutathione lyase, septin-2, striatin, T-complex protein 1 subunit alpha, thimet oligopeptidase, ubiquitin carboxyl terminal hydrolase isozyme L1이었다. 이들 중 thimet oligopeptidase, T-complex protein 1 subunit alpha, glycine tRNA ligase, isoform M1 of pyruvate kinase의 경우 정상군에 비해 MPTP군에서 유의하게 발현이 증가하고 천마군에서 MPTP군에 비해 유의하게 감소한 것이 관찰되었다. isoform 3 of dynamin-1의 발현은 정상군에 비해 MPTP군에서 증가하였지만 통계적으로 유의하지 않았고, 천마군에서는 MPTP군에 비해 유의하게 감소하는 양상을 보였다. Gelsolin, lactoylglutathione lyase, ubiquitin carboxyl terminal hydrolase isozyme L1의 발현은 MPTP군에 비해 천마군에서 유의하게 증가하였으며, septin-2와 striatin의 경우 정상군과 MPTP군에 비해 천마군에서 발현이 유의하게 증가하였다(Table 1, Fig. 4).

Profile of 11 differentially expressed proteins found in the 2D SDS-PAGE

No. Name Theoretical Gel MASCOT score Saline/MPTP MPTP+GEB/MPTP


Mr (kDa) pI Mr (kDa) pI
1 Gelsolin 81.00 5.52 84.00 7.00 189 1.15 1.75
2 Glycine tRNA ligase 82.62 6.24 69.87 7.79 205 0.46 0.40
3 Heat shock cognate 71 kDa protein 71.06 5.37 60.26 6.61 136 1.42 2.61
4 Isoform 3 of dynamin-1 96.21 6.32 88.94 8.12 144 0.42 0.61
5 Isoform M1 of pyruvate kinase PKM 58.46 6.69 55.34 8.63 160 0.16 0.21
6 Lactoylglutathione lyase 20.97 5.24 21.26 5.86 129 1.30 1.52
7 Septin-2 37.18 5.74 38.07 8.14 122 2.52 18.21
8 Striatin 86.37 5.12 100.28 5.97 168 0.57 10.36
9 T-complex protein 1 subunit alpha 60.87 5.82 59.47 7.71 90 0.23 0.13
10 Thimet oligopeptidase 78.77 5.72 71.10 7.48 141 0.29 0.13
11 Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase isozyme L1 25.17 5.14 22.29 5.83 103 1.30 1.10

GEB : Gastrodia elata Blume, MPTP : 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.



Fig. 4. Protein levels differentially expressed in the substantia nigra. Data was presented as the mean±standard deviation. *p<0.05, ***p<0.001 versus control group, #p<0.05, ##p<0.01, and ###p<0.001 versus MPTP group. GEB, Gastrodia eleta Blume; MPTP, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.
고 찰

최근 발표된 천마의 파킨슨병 관련 연구를 살펴보면, 천마의 지표물질인 gastrodin이 파킨슨병 세포 모델, 초파리 모델에서 도파민성 신경세포를 보호하고14,15), 천마가 6-hydroxydomapine 유도 생쥐 모델에서 레보도파 투여로 인한 떨림을 억제한다고 보고되었지만13), 흑질 내 도파민성신경세포 보호 효과 및 관련 기전을 보고한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구는 파킨슨병 동물모델을 제작하는데 널리 사용되는 신경독소인 MPTP를 생쥐에 투여하여 파킨슨병을 유발한 뒤 천마의 도파민성 신경세포 보호 효과를 확인하였으며, 이와 관련된 인자를 종합적으로 파악하기 위해 이차원 전기영동을 실시한 결과 11종의 단백질이 통계적으로 유의하게 변화한 것을 확인하였다.

Thimet oligopeptidase는 금속 단백질분해효소로, 발현이 증가하면 안지오텐신 제2형 신호전달을 감소시킨다. 이는 아밀로이드-베타 유도 독성으로부터 신경세포를 보호하는 것으로 알려져 있다16). 또한 안지오텐신 제2형 수용체가 결손되면 미토콘드리아 호흡률이 증가하여 산화스트레스를 억제하고 결과적으로 도파민성신경세포를 보호한다는 연구 결과가 존재한다17). 본 연구에서는 thimet oligopeptidase가 MPTP를 투여하면 유의하게 증가하고 천마를 함께 투여하는 경우 유의하게 감소하는 것을 확인하였는데, 이는 천마가 MPTP로 인한 산화스트레스를 억제함으로써 도파민성신경세포를 보호한 것을 의미한다.

알파-시누클레인은 파킨슨병의 병인으로 주목되는 단백질로, 이 단백질이 응집되면 신경세포를 파괴하여 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경질환을 유도한다18,19). Gelsolin은 actin filament의 형성을 조절하는 핵심 조절자로, 발현이 증가하면 자가포식 활성화를 통해 알파-시누클레인 응집을 억제한다20). T-complex protein 1은 세포 골격을 조절하는 단백질로, 불활성 gelsolin과 결합하여 gelsolin의 작용을 억제한다21). 따라서 본 연구에서 관찰된 T-complex protein 1의 발현 억제 및 gelsolin의 증가는 천마가 gelsolin에 의한 자가포식을 유도하여 알파-시누클레인 응집을 억제하는 기전으로 도파민성신경세포를 보호한 것을 의미한다.

Glycine tRNA ligase는 단백질 번역에 연관된 효소로, 이 단백질이 메티오닌에 의해 핵으로 이동하면 mTOR를 전사시켜 자가포식을 억제한다22). 본 연구에서 MPTP 투여는 glycine tRNA ligase의 발현을 유의하게 억제하고 천마는 이를 유의하게 개선하였는데, 이는 천마의 흑질 내 도파민성신경세포 보호효과에 자가포식이 관여한다는 것을 보여주는 추가적인 근거라 할 수 있다.

Pyruvate kinase M1은 포스포엔올피루브산을 피루브산으로 대사시키는 효소이다23). 피루브산은 젖산 탈수소효소에 의해 젖산으로 대사되는데, pyruvate kinase M1이 과발현하면 젖산이 증가하고 동시에 알파-시누클레인이 젖산의 농도에 비례하여 축적된다24,25). 또한 MPTP를 투여한 생쥐에서 젖산과 젖산 탈수소효소의 증가가 관찰되는데26), 이는 MPTP가 pyruvate kinase M1의 과발현을 유도하고 이로 인해 젖산이 증가하여 알파-시누클레인의 축적을 유발하는 것을 의미한다. 본 연구에서도 MPTP 투여 시 pyruvate kinase isoform M1이 증가하였고 천마 투여시 MPTP로 인해 과발현된 pyruvate kinase isoform M1이 정상 수준으로 감소하였는데, 이는 천마가 pyruvate kinase isoform M1의 과발현을 억제함으로써 젖산의 생성을 억제하고 알파-시누클레인의 축적을 예방한다는 것을 의미한다.

Heat shock cognate 71 kDa 단백질은 소포체 근처에 분포하며 단백질 접힘에 관여하는 단백질로, 소포체 스트레스로 인해 생성된 잘못접힘 단백질을 분해하는데 도움을 준다27). 이 단백질은 연령이 증가함에 따라 발현량이 감소하는데, 이는 산화스트레스의 증가와 관련있다28). 본 연구에서 천마 투여 시 흑질 내 heat shock cognate 71 kDa 단백질의 발현이 증가하였는데, 이는 천마가 산화 스트레스를 억제하고 잘못접힘 단백질을 분해함으로써 도파민성신경세포를 보호하는 것을 의미한다.

신경돌기의 단축은 산발성 파킨슨병에서 나타나는 신경퇴행의 특징 중 하나이다29). Leucine-rich repeat kinase 2는 파킨슨병의 발병 기전에 중요한 역할을 하는 단백질인데, 이 단백질이 단독으로 작용할 때 보다 dynamin-1과 결합했을 때 신경돌기의 단축이 더욱 촉진되고, 신경세포에서 dynamin-1이 과발현되어도 신경돌기가 단축된다30). 본 연구에서 천마가 dynamin-1의 과발현을 유의하게 억제하였는데, 이는 천마가 파킨슨병으로 인한 신경돌기의 단축 등 신경 퇴행으로 인한 변화를 억제할 가능성이 존재한다는 것을 의미한다.

Lactoylglutathione lyase는 세포질에 존재하는 glyoxalase system을 구성하는 효소 중 하나로, 세포 내에서 단백질과 DNA 손상을 유발할 수 있는 메틸글리옥살을 젖산으로 전환하는 데 중요한 역할을 한다. 또한 lactoylglutathione lyase의 과발현을 유도하면 산화스트레스와 염증의 증가를 유도함으로써 세포사멸을 촉진하는 advanced glycation endproducts의 발현이 억제된다31). MCF-7 세포에 방사선을 조사하면 세포사멸이 증가하는데 lactoylglutathione lyase의 발현을 억제하면 세포사멸이 더욱 가속화되고, 방사선 조사 후 항산화제를 투여하면 세포사멸이 감소하면서 동시에 lactoylglutathione lyase의 발현도 회복된다32). 본 연구에서 천마 투여 시 lactoylglutathione lyase의 발현이 증가하였는데 이는 MPTP 투여로 인한 도파민성신경세포의 사멸 억제 효과와 관련이 있는 것으로 추정된다.

시냅스의 기능 이상과 퇴화는 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경질환에서 자주 나타난다33). Septin-2는 세포질과 시냅스 주변에서 세포골격의 조성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, septin-6, 7와 함께 중합체를 형성하여 세포골격 조절에 관여하기도 한다34,35). 본 연구에서 관찰된 천마에 의한 septin-2의 증가는 천마가 시냅스 주변 세포골격 조절을 통해 신경 기능 유지에 관여한다는 것을 의미한다.

Striatin은 calmodulin 결합 단백질로 striatin 상호작용 인산가수분해효소 및 인산화효소 복합체(STRIPAK)의 구성성분이다36). STRIPAK 복합체는 자가포식체를 축삭돌기로 운반하는 매개체로 알려져 있기에37), 천마로 인한 striatin의 증가는 천마가 자가포식을 통해 도파민성신경세포를 보호할 수 있다는 점을 시사한다.

Ubiquitin carboxy-terminal esterase L1은 신경에 다량 분포하는 단백질로38), 이 단백질이 결손된 생쥐에게서 ubiquitin의 감소 및 운동기능의 저하가 관찰되었고39), 이 단백질이 결손된 초파리는 체내에 다량의 활성산소가 생성되면서 운동기능이 저하되었다40). 본 연구에서 관찰된 천마 투여로 인한 ubiquitin carboxy-terminal esterase L1 발현의 증가는 천마가 ubiquitin carboxy-terminal esterase L1의 증가를 통해 활성산소를 억제하면서 운동기능을 개선한다는 것을 의미한다.

종합하면, 천마는 산화스트레스, 단백질의 응집 및 잘못접힘 증가, 신경돌기 단축을 억제하고, 자가포식을 촉진하며, 세포골격을 조절함으로써 MPTP로 인한 도파민성신경세포의 파괴를 억제할 가능성이 높다. 하지만 본 연구는 이차원 전기영동을 통해 확인한 단백질의 변화를 바탕으로 천마의 작용 기전을 추정하였을 뿐 실제로 각 기전과 관련된 주요 지표들을 확인하지는 못하였다는 한계가 존재한다. 추후 심도 있는 연구를 통해 파킨슨병에 대한 천마의 효과 및 기전을 입증하고, 나아가 새로운 한의학적 파킨슨병 치료법을 확립하는 데 기여할 것이다.

결 론

MPTP 유도 파킨슨병 생쥐 모델에서 70% 에탄올 천마추출물의 도파민성신경세포의 보호효과를 면역조직염색화학법으로 확인하고 이차원 전기영동을 통해 단백질체의 변화를 조사한 결과, 천마추출물은 파킨슨병 유발 생쥐의 흑질 내 도파민성신경세포를 보호하고, 총 11종의 단백질 발현을 조절하는 효과가 있음을 확인하였다. 이들 11종 단백질의 기능을 고려할 때, 천마추출물은 세포질 및 미토콘드리아 내 단백질의 손상 및 변성을 억제하고, 알파-시누클레인의 축적을 예방하며, 자가포식을 활성화하고 세포골격 및 신경돌기를 유지하는 효과를 통해 도파민성신경세포의 사멸을 억제하는 것으로 추정된다. 이러한 연구 결과는 천마가 파킨슨병의 발병 및 진행을 억제하는데 도움이 될 가능성이 존재함을 의미하며, 나아가 천마를 이용한 파킨슨병 치료법 확립에 기여할 것이다.

Acknowledgement

None.

Funding

This study was supported by a research grant of the Health Fellowship Foundation.

Data availability

The authors can provide upon reasonable request.

Conflicts of interest

저자들은 아무런 이해 상충이 없음을 밝힌다.

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December 2022, 39 (4)
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